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インシリコバイオロジー株式会社

クローニング

 

IMCは、クローニング実験の操作をコンピュータ上で実行できることに特徴があります。この際、特殊なデータは不要で、GenBankやEMBLなどの公的なデータベースから入手できる塩基配列データをそのままクローニングすることが可能です。クローニングは注釈付の配列をそのまま、制限酵素消化、PCRプライマー設計、PCR増幅、ライゲーションを実行できます。結果として得られるクローニング生産物はすべてGenBank/EMBLフォーマットで出力されます。Primer情報は塩基配列上に貼り付けられ保存されるるため、Primerの管理にも有用です。

  • 実際に切断・ライゲーションできるクローニング機能です。
  • インシリコのクローニング実験が可能です。
  • 目に見えない分子生物学実験を理解する助けになります。 分子生物学実験の補助やシミュレーションに使用できます。
  • 任意のVector/Plasmidをコンストラクトできます。
  • Vectorへのインサートチェックに最適な制限酵素をリストアップし、そのゲル電気泳動結果をシミュレート表示します。
  • 制限酵素処理(制限酵素地図、制限酵素消化断片生成、インサートチェックに最適な制限酵素候補リスト、その他)
  • PCRプライマー設計、
  • 特定のフィーチャー上を避けるプライマー設計、
  • PCRによる複製(注釈含む)、
  • 全遺伝子を増幅する一括プライマー設計、
  • プライマー管理 ライゲーション、セルフライゲーション、
  • 塩基断片末端形状適合性チェック
  • プラスミドマップ作成(インサート領域吹出機能) (レイアウトスタイル対応)
  • 注釈を記述したままのクローニング DNA末端への制限酵素認識部位の付加
  • DNA末端平滑化(Blunting)、リン酸化(脱リン酸化
  • 注釈付き塩基配列の任意領域切り出し

IMC Ver. 7.13 リリース

  1. フィーチャキーの形状に異なる太さの垂直線が追加されました。
    • 太さは1~5ピクセルです。 フィーチャーの中心に描画されます。
    • エクソン、イントロンなどJoinで分かれてる場合は各joinの中心に描画されます
  2. コドン置換機能で、全CDS一括処理の他に指定したCDSのみを処理する機能が追加されました。
  3. 参照ゲノムにfastaファイルまたはCDSを持たないgenbankファイルをロードして、ホモロジー検索を実行するとエラーとなるバグが修正されました。
  4. 環状ゲノム(N,1)をまたぐ配列でプライマーをデザインするとN,1をまたぐ配列を増幅できないプライマーがデザインされるバグが修正されました。
    • デザインされたプライマー自体は問題がありませんでした。
    • デザイン結果の位置設定でバグがありました。
  5. プラスミドマップである条件を満たすとフィーチャーが表示されないバグが修正されました。

IMC Ver. 7.12 リリース

  1. Bug #2188: N,1をまたぐフィーチャーの位置情報表示の際、Nより大きい値が表示されるバグが解決されました。
  2. Bug #2189: 指定範囲の右クリックで表示されるメニューが異なる場合がある問題が解決されました。
  3. Spec #2187: 指定範囲を増幅する最適プライマーをすでに登録されたプライマー中から検索する機能が追加されました。
  4. Spec #2190: CDSを特定の制限酵素で切断されないように配列置換する機能が追加されました。
    • 置換するコドンは指定されたコドン頻度表に基づき、使用頻度の高いものを選択する。
    • 置換されたコドンはQualifier /modified_base=に保存する。
  5. Spec #2186: LGRMにて、Multiple CSVファイル出力を自動的に保存するように変更されました。
    • 従来は、解析の最後にダイアログが表示され、保存するかどうかを尋ねられました。
    • 今回修正後は、実行前に保存するかどうかを尋ね、実行時にはその指定に基づき自動的に保存を行い、終了するように変更されました。

IMC Ver. 7.10 リリース

  1. Primer Feature Positionが1塩基ずれるバグが修正されました。
    • Insert New Feature でマップ上にプライマーをフィーチャーとしてを登録すると、1塩基分ずれて登録されていました。
  2. ディレクトリツリーのファイル名をソートする機能が追加されました。
    • カレントディレクトリ上で右クリック → Sort Filename → 昇順/降順でソートが実行されます。
    • ソートできるのは現在のところカレントディレクトリのみです。

IMC I01 RE02 制限酵素認識部位をフィーチャーレーン上に描画する

使用するソフトウェア

  1. IMC Edition:   

 

機能

制限酵素認識部位をフィーチャーレーン上に他のフィーチャーと混在させて描画することができます。

用意するデータ

  1. 塩基配列ファイル(DDBJ, EMBL, GenBank, FastA, ABI/SCF, Plain Textなど)

 

操作

 

  1. IMCを起動します。
  2. 塩基配列ファイルを読みこみます。
  3. Cloning -> RE Recognition を選択します。
  4. Enzyme Selection ダイアログが表示されます。
  5. 表示したい制限酵素にチェックします(複数指定可能)。
  6. Show Recognition Siteボタンをクリックします。
  7. Recognition Siteダイアログが表示されます。
  8. 制限酵素を選択します。
  9. 制限酵素認識部位のリストが表示されます。
  10. 地図上に表示する制限酵素認識部位にチェックします。
  11. Insert New Featureボタンをクリックします。

IMC I01 RE04 フィーチャーレーンと並行に制限酵素地図を描く

機能

メインウィンドウ上に、メインフィーチャーレーンと並行に制限酵素認識部位を表示する「制限酵素レーン」を表示します。

  • 1つの制限酵素レーンには、複数の制限酵素を指定可能です。
  • メインフィーチャーマップ上には複数の制限酵素地図レーンを登録・表示可能です。
  • 制限酵素地図レーン上の各認識部位はフィーチャーとしては登録されません。
  • 制限酵素地図レーンは、メインフィーチャーマップ上の任意の位置に移動可能です。
  • 制限酵素地図レーンを、一時的に不可視化することが可能です。

用意するデータ

  1. 塩基配列ファイル(DDBJ, EMBL, GenBank, FastA、ABI/SCF,などのフォーマット)

使用するソフトウェア

  1. IMC Edition:   

操作

  1. IMCを起動します。
  2. 塩基配列ファイルを読み込みます。
  3. Option Setting -> Layout Styleメニューを選択します。
  4. Add ボタンをクリックします。
  5. Lane Styleダイアログが表示されます。
  6. Lane TypeにはEnzyme Mapを選択します。
  7. 表示したい制限酵素を選択します(複数選択可)。
  8. Setボタンをクリックします。
  9. Applyボタンをクリックします。
  10. フィーチャーマップに並行に宣言酵素地図が表示されます。

I01L 環状プラスミドベクターを制限酵素で開環する

環状のプラスミドベクターのマルチクローニングサイト(MCS)を1箇所切断する制限酵素を使用して、ベクターの開環(線状化)を行います。ベクターへのクローニングの準備です

 

実装ソフトウェア/エディション

  • IMC/SE,GE,AE DS
  • GT

 使用データ 

  • ベクター塩基配列ファイル(*) :例 (Expression_vector_pColdIV.gbk)
  • 制限酵素(**) :例 BamHI 

操作方法

  1. 配列ファイル読み込みボタンをクリックし、すると表示されるファイル選択ダイアログからベクター塩基配列をIMCに読み込みます。 このとき、配列種類指定ボタンがAutoあるいは、N.A.となっていることを確認します。A.Aとなっていいると核酸配列でもアミノ酸配列として認識されてしまいます。
    • IMCメイン画面左側の反応チューブに円形のDNAアイコンが表示されます。
  2. 線形アイコンが表示された場合は、セルフライゲーションによる線状ベクターの環状化を行います。
  3. ツールボックスから制限酵素ボタンをクリックします。
    • 制限酵素リストウィンドウが表示されます。
  4. Any Enzyme ラジオボタンをオンにします。
    • その下のフィールドが2箇所入力可能となります。 + from フィールド、to フィールドの両方に1を入力します。
    • これは与えられたDNA塩基配列を1箇所だけ消化切断する制限酵素を表示せよという意味です。
  5. 制限酵素リストウィンドウの下部にあるSelect Allボタンをクリックします。
    • これは表示されている制限酵素を全部選択するという意味です。-- この操作ですべての制限酵素にチェックが入ります。
  6. Show Recognition Siteボタンをクリックします。
    • 別のウィンドウが開きます。
  7. このウィンドウには最初に左側に制限酵素の名称と現在メイン画面に表示されているベクター塩基配列を認識する部位の数がリストされています。
    • 1箇所だけ認識するという制限を入れたため、ここは1の制限酵素だけが表示されています。
  8. そのうちのひとつの制限酵素(例ではBamHI)にチェックを入れます。
    • 右側の認識部位を示すリストも表示されるようになります。
  9. この行の先頭にあるチェックボックスにチェックを入れます。
    • ベクターの塩基配列のある領域がブルーに網掛けされます。
    • 多くの制限酵素認識部位が集まっている箇所がMCS(マルチクローニングサイト)です。
  10. 使用する制限酵素(例ではBamHI)の認識部位がMCSにあることを確認します。
  11. Digestionボタンをクリックします。
  12. 実行確認メッセージが表示されます。
    • Yesをクリックします。
  13. 制限酵素消化断片のリストが表示されます。
    • この場合は、断片は1つです。
  14. 制限酵素消化断片(この場合は1断片のみ)をチェックして、選択してLOADボタンをクリックします。
    • LOAD確認メッセージおよび完了メッセージが表示されます。
    • 反応チューブ内に新たに線状のアイコンが生成されます。
  15. 制限酵素消化断片リスト画面をCloseボタンをクリックして閉じます。
  16. Recognition Site画面をClose ボタンをクリックして閉じます。
  17. 線状のアイコンをクリックします。
    • 開環された線状のベクター配列のフィーチャーマップが表示されます。
    • その先頭一は、BamHIサイトになっています。
    • ベクター塩基配列に注釈がついていれば、フィーチャーマップ上にそれぞれのフィーチャーがグラフィカルに表示され、その内容を見ることができます。
    • 先頭および最後の塩基配列の一部が緑色で表示されます。これは、緑色の部分が存在せずシングルストランドとなっていることを示します。
  18. この後、プラスミドマップ描画・印刷ボタンをクリックして、プラスミドマップを表示すると、環状のマップが描かれます。

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