Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC007


レアカッター制限酵素による全ゲノムの大型断片化


微生物ゲノム全体をレアカッター制限酵素で大型断片化します。この際、消化断片の末端は粘着末端(突出末端)および平滑末端でも正しく保存されます(ライゲーションの際にタイプと配列の相補性が判定されます)。


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


1.全ゲノム断片塩基配列ファイル(*、**):例(Escherichia_coli_K-12_MG1655.gbk)

2.制限酵素(I-CeuI)

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE Ver1.3

*DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。

**例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから微生物全ゲノムDNA塩基配列(Escherichia_coli_K-12_MG1655.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.制限酵素反応ボタンをクリックします。

5.すると右のような、制限酵素反応ダイアログが表示されます。このダイアログでは登録されている制限酵素リストから、目的の制限酵素を選択し、1で読み込んだ塩基配列を消化切断する酵素を探します。

6.今回は26塩基を認識するレアカッター制限酵素であるI-CeuIを利用して、微生物全ゲノムを数個の断片にします。

7.それでは、実際に制限酵素反応を実験してみましょう。

8.すでに、使用する制限酵素が判明しているので、制限酵素リストから直接使用するI-CeuIを選択します。選択はI-CeuIにチェックマークをつけるだけです。

9.次に、Show recoginition site...ボタンをクリックします。すると、制限酵素認識サイト検索結果ウィンドウが表示されます。この場合5箇所の認識部位が発見されます。

10.それにチェックマークをつけると、右側のリストに5箇所の認識サイトの詳細な情報が表示されます。

11.この5箇所のリストのうち、1つをクリックしてみると、フィーチャーマップはその部位にただちにジャンプします。

12.フィーチャーマップ上部の塩基配列表示領域には、I-CeuIの認識部位がカラーで表示され、切断箇所も表示されています。

13、チェックマークをつけた認識部位については、実際に切断することのほか、認識部位をフィーチャーとして登録することや、CSVファイルやFastAファイルとして出力することなどが可能です。

14.それでは、実際に大腸菌環状ゲノムを消化切断してみましょう。5箇所の認識部位すべてにチェックマークをつけて、ウィンドウ下部のDigestionボタンをクリックします。すると、右の確認メッセージが表示されますので、Yesをクリックします。すろと、下に示す、消化断片のリストウィンドウが表示されます。

15.これら5つのDNA断片について、以下のことが可能です。まず、断片情報をCSVあるいはFastA形式でファイル出力可能です。次に、編集プールにLOADすると同時に、Genbank/EMBL形式ファイルとして保存できます。ここでは、enbank/EMBふ形式ふファイルとして5つ全部を保存し、編集プールにLOADしてみましょう。

16.Loadボタンをクリックすると、右の確認メッセージが表示され、Yesをクリックすると、ファイル選択ダイアログが表示されます。これは、生成される断片ファイルを保存する場所を指定するためのものです。デフォールトのファイル名が設定されているので、そのファイル名でよければOKをクリックします。すると、処理が開始され、完了すると、完了のメッセージが表示されます。

17.編集プールにはLOADされた5個の断片のアイコンが表示されますので、そのうちの1つをクリックすると今度はその断片のフィーチャーマップが表示されます。これをみると、大腸菌の一部領域がs注釈付のまま、複製されていることがわかります。