Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC003


タグ付きプライマー設計とPCR

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PCRプライマーにタグを付けたい場合は


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


  1. 鋳型DNA塩基配列ファイル(*) : 例(Bsub_50kb.gbk)
  2. プライマー塩基配列(**) :例(primer_sample01.dat)
  3. 実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*鋳型DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です

**プライマーは新規に入力することや、他のソフトウェアからコピーすることが可能です。

***例はIMCのサンプルに登録されています。


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから鋳型DNA塩基配列(例の場合はBsub_50kb.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.プライマー塩基配列がすでに登録されている場合はプライマー登録ボタンをクリックして、プライマー登録画面を開きます。

5.ここに目的のプライマーセットがない場合は、別のプライマーファイル(例の場合はprimer_sample01.dat)を読み込みます。読み込み方は、Readボタンをクリックします。すると、ファイル選択ダイアログが表示されるので、プライマーファイル(例の場合は、primer_sample01.dat)を指定し、開きます。

6.タグをつけたいプライマーにチェックをし、画面下部のEditボタンをクリックします。

7.するとプライマー編集ダイアログが表示されます。

8.表示されているプライマー塩基配列フィールドに直接塩基配列を挿入します。例としてgを10個挿入します。挿入配列をプライミングサイトとの相補性をチェックさせないためにタグの挿入配列は英小文字(agct)とします。大文字で入力すると鋳型DNAとの相補性がチェックされるため、プライミングサイトを認識しなくなります。タグの挿入位置はForwardおよびReverseともフィールドの一番先頭、すなわち5‘側にします。Reverse PrimerはForwardと同じ向きに表示されていますので、5’側はプライマーの先頭となります。

9.タグ配列を挿入し終えたら、Saveボタンをクリックして、変更を保存します。

10.ここで、PCRボタンをクリックすると、表示されるプライマー選択ダイアログで、今タグをつけたプライマーにチェックをつけて選択します。そしてReactionボタンをクリックします。

11.タグが付加されたプライマーのプライミングサイトが表示され、小文字でタグ配列を挿入しても、プライミングサイトに影響がないことがわかります。

12.プライミングサイトにチェックをつけた後、Add New Featureボタンをクリックすると、プライミングサイトをフィーチャーとして登録することができます。

13、プライミングサイトを新規フィーチャーとして登録するかの確認メッセージが表示されるので、これにYesをクリックします。登録が終了すると終了メッセージが表示されます。すると、フィーチャーマップ上にプライミングサイトが新規フィーチャーとして表示されます。