Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC005


塩基配列からのコピーによるPCRプライマー設計


フィーチャーマップ上部に表示されている塩基配列から直接マウスのドラッグにより、プライマー配列候補を転記し、PCRを実行します。


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


1.鋳型DNA塩基配列ファイル(*) : 例(Bsub_50kb.gbk)

2.プライマー塩基配列(**) は1からコピーします。

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*鋳型DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です

**プライマーは新規に入力することや、他のソフトウェアからコピーすることが可能です。

***例はIMCのサンプルに登録されています。


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから鋳型DNA塩基配列(例の場合はBsub_50kb.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.ここではマップの上部に表示されている塩基配列から直接にプライマーを設計する方法を行います。

5.ズームボタンおよび左右のシフトボタンを使って、マップ上に表示されているDNAの領域のうち、PCRで増幅したい領域を選択、表示します。(検索ボタンを利用しても、増幅したい領域を発見することが可能です。

6.線カーソルをマップ上の増幅したい領域より左側に移動します。そこで表示されている塩基配列からプライマーに適していると思われる領域をマウスでドラッグします。ドラッグする塩基数は20mer程度にします。塩基配列上でマウスをドラッグすると、ドラッグされた領域が赤く網掛けされます。赤く網掛けされた領域が指定領域となります。

7.その領域で、マウス右クリックすると、プルダウンメニューが表示され、その中に、Insert As a New Primerというメニューがあり、それをクリックすると、プライマー登録ダイアログが表示されます。

8.プライマー登録ダイアログには、マウスでドラッグした領域の塩基配列が入力された状態で表示されます。塩基配列を変更する必要がない場合は、プライマー配列に名前を入力して、Saveボタンをクリックすると登録されます。

9.ここで、PCRボタンをクリックすると、表示されるプライマー選択ダイアログで、今登録したプライマー名にチェックをつけて選択します。そしてReactionボタンをクリックします。

10.するとPriming Site Windowが表示されます。最初はWindowの左側のリストに、プライマー名とDNA塩基配列中に発見されたそれぞれのPriming Siteの数が表示されます。

11.それぞれにチェックをつけると、今度は右側のリストにチェックをつけたプライマーのすべてのPriming Siteの位置が表示されます。

12.Priming Siteリストから2つのサイトにチェックします。

13.画面下部のAmplifyボタンをクリックします。

14.すると、PCRの実行を確認するダイアログが表示されるので、これにYesを応えます。

15.PCRの実行が終わるとファイル保存ダイアログが表示され、生成されたPCRプロダクトファイルをどのようなファイル名で保存するかを指定します。デフォールトファイル名は、DNAファイル名、フォワードプライマー名、リバースプライマー名をアンダースコア(_)で連結したもので、さらに最後に数字5桁の連番が付加されます。拡張子はgbkとなりますが、.emblとすると、EMBLフォーマットで出力されます。保存ボタンをクリックすると保存されます。

16.生成されたPCRプロダクトは同時に反応チューブにも線状のアイコンで表示されます。これをクリックするとそのマップが表示されます。

17.このPCRプロダクトをベクターにインサートしてクローニングを行うにはプロトコルXXを参照してください。