Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC004


プライマーへの変異導入とPCR


プライマー配列に変異や挿入を導入してPCRを実行します。


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


1.鋳型DNA塩基配列ファイル(*) : 例(Bsub_50kb.gbk)

2.プライマー塩基配列(**) :例(primer_sample01.dat)

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*鋳型DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です

**プライマーは新規に入力することや、他のソフトウェアからコピーすることが可能です。

***例はIMCのサンプルに登録されています。

 


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから鋳型DNA塩基配列(例の場合はBsub_50kb.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.プライマー塩基配列がすでに登録されている場合はプライマー登録ボタンをクリックして、プライマー登録画面を開きます。

5.ここに目的のプライマーセットがない場合は、別のプライマーファイル(例の場合はprimer_sample01.dat)を読み込みます。読み込み方は、Readボタンをクリックします。すると、ファイル選択ダイアログが表示されるので、プライマーファイル(例の場合は、primer_sample01.dat)を指定し、開きます。

6.タグをつけたいプライマーにチェックをし、画面下部のEditボタンをクリックします。

7.するとプライマー編集ダイアログが表示されます。

8.表示されているプライマー塩基配列フィールドに直接塩基配列を挿入します。例としてgを10個挿入します。挿入配列をプライミングサイトとの相補性をチェックさせないためにタグの挿入配列は英小文字(agct)とします。大文字で入力すると鋳型DNAとの相補性がチェックされるため、プライミングサイトを認識しなくなります。タグの挿入位置はForwardおよびReverseともフィールドの一番先頭、すなわち5‘側にします。Reverse PrimerはForwardと同じ向きに表示されていますので、5’側はプライマーの先頭となります。

9.タグ配列を挿入し終えたら、Saveボタンをクリックして、変更を保存します。

10.ここで、PCRボタンをクリックすると、表示されるプライマー選択ダイアログで、今タグをつけたプライマーにチェックをつけて選択します。そしてReactionボタンをクリックします。

11.タグが付加されたプライマーのプライミングサイトが表示され、小文字でタグ配列を挿入しても、プライミングサイトに影響がないことがわかります。

12.プライミングサイトにチェックをつけた後、Add New Featureボタンをクリックすると、プライミングサイトをフィーチャーとして登録することができます。

13、プライミングサイトを新規フィーチャーとして登録するかの確認メッセージが表示されるので、これにYesをクリックします。登録が終了すると終了メッセージが表示されます。すると、フィーチャーマップ上にプライミングサイトが新規フィーチャーとして表示されます。

14.ズームボタンをクリックして新規に登録されたプライマーのフィーチャーを拡大します。そしてそのフィーチャーを左クリックします。すると、上部の塩基配列のプライミングサイトに相当する領域が赤で表示されます。

15.ここで、画面下部のAmplifyボタンをクリックします。

16.すると、PCRの実行を確認するダイアログが表示されるので、これにYesを応えます。

17.PCRの実行が終わるとファイル保存ダイアログが表示され、生成されたPCRプロダクトファイルをどのようなファイル名で保存するかを指定します。デフォールトファイル名は、DNAファイル名、フォワードプライマー名、リバースプライマー名をアンダースコア(_)で連結したもので、さらに最後に数字5桁の連番が付加されます。拡張子はgbkとなりますが、.emblとすると、EMBLフォーマットで出力されます。保存ボタンをクリックすると保存されます。

18.生成されたPCRプロダクトは同時に反応チューブにも線状のアイコンで表示されます。これをクリックするとそのマップが表示されます。ここで、PCR産物の5‘末端をみると、タグとして小文字で挿入した塩基配列が、大文字で産物の塩基配列に組み込まれていることが判ります。

19.このPCRプロダクトをベクターにインサートしてクローニングを行うにはプロトコルXXを参照してください。