Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC015


直鎖化(開環)されたベクターへPCR増幅DNA断片のライゲーション


直鎖化されたベクターとPCRで増幅されたDNA断片をライゲーションされ、DNA断片がインサートされたベクターを作成します。ライゲーションできないケースも実験します。


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


1.PCR増幅DNA断片塩基配列ファイル(*、**):例(Bsub_50kbL_PCR.gbk)

2.直鎖状ベクター Expression_vector_pColdIVL_BamHI.gbk

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。。

**例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから微生物全ゲノムDNA塩基配列(Bsub_50kbL_PCR.gbk)をIMCに読み込みます。また、直鎖化されたベクター Expression_vector_pColdIVL.BamHI.gbkをよみこみます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに2個の線形DNAアイコンが表示されます。

3.まず、このままライゲーションを行ってみます。ライゲーションボタンをクリックします。

4.すると、ライゲーションダイアログが表示されるので、1st Fragmentとして直鎖状ベクター、2nd Fragmentとして、PCR増幅DNA断片を指定します。

5.なお、Self Ligationにチェックが入っている場合は、2つの断片のライゲーションはできませんので、これをはずしておきます。

6.また、End Checkにチェックが入っていない場合は、チェックしておきます。

7.ライゲーションボタンをクリックします。すると、ライゲーション確認メッセージが表示されるので、Yと応えます。

8.すると、以下のようなエラーメッセージが表示され、ライゲーションができないことが示されます。これは、2つのDNA断片の両端の形状が一致していないためです。

9.直鎖状のベクターは制限酵素BamHIの消化末端形状をしています。しかし、PCR増幅断片はそのような形状をしていません。

10.それで今度は、PCR増幅DNA断片の両端に制限酵素消化末端を付着させてから、同じ実験をやってみます。

11.制限酵素消化末端付加ボタンをクリックします。すると、制限酵素のリストダイアログが表示されます。

12.このリストから、BamHIの行を選び、その5’と3’のカラムにチェックします。そして、Add Enzyme siteボタンをクリックします。

13.すると、確認メッセージが表示されるので、Yと応えると、両端にBamHIの消化末端が付着します。

14.実際にライゲーションを行い確かめてみます。

15.再度、ライゲーションボタンをクリックします。

16.ライゲーションダイアログが表示されるので、以前と同様に、1st Fragmentとして直鎖状ベクター、2nd Fragmentとして、PCR増幅DNA断片を指定します。

17.ライゲーションボタンをクリックします。すると、ライゲーション確認メッセージが表示されるので、Yと応えます。

18.すると、今度は以下のようなライゲーション反応産物リストウィンドウが表示されます。

19.ライゲーション反応物リストには2つ表示されています。これは、PCR増幅断片が逆にインサートされている場合を含むからです。

20.2つの反応産物を反応チューブにLOADします。これには、両方にチェックをつけ、LOADボタンをクリックします。すると、反応チューブに2つの環状DNAアイコンが出現します。

21.それぞれのプラスミドマップを描いてみます。プラスミドマップの描き方はProtocol xxを参照してください。逆向きにインサートが入っているのがわかります。