Protocol 更新情報

2010/2/26 PL003

2009/11/4 PH003

2009/11/4 PH002

2009/8/12 PC002

2009/8/11 PC001

 

 

in silico Protocol: PC008


DNA断片への制限酵素消化末端付加

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DNA断片の5’あるいは3’末端に制限酵素による消化末端を付加します。通常は2本鎖の完全認識部位を付加し、その後制限酵素により消化しますが、ここでは、消化された後の突出末端の状態で付加します。平滑末端の場合はそのままです。


以下のインシリコ実験には、IMCを使用


試薬・装置


1.全ゲノム断片塩基配列ファイル(*、**):例(Bsub_50kbL.gbk)

2.制限酵素(EcoRI, HindIII)

3.実行ソフトウェア:IMCSE/GE/AE

*DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。

**例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples

 


方法


1.塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから微生物全ゲノムDNA塩基配列(Bsub_50kbL.gbk)をIMCに読み込みます。

2.IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。

3.ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。

4.制限酵素認識配列付加ボタンをクリックします。

5.すると右のような、制限酵素選択ダイアログが表示されます。

6.1で読み込んだDNA断片の5’末端にEcoRIサイトを、3’末端にHindIIIサイトを付加するために、2つの制限酵素を探します。両方とも6塩基認識酵素で、Palindromicなので、それぞれ6bpとPalindromicにチェックを入れます。すろと、その条件に一致する制限酵素だけがリストされます。

7.スクロールさせて、EcoRIを見つけます。EcoRIの5‘チェックボックスにチェックを入れます。さらに、HindIIIの3’チェックボックスにチェックを入れます。

8.ここで、下部のAdd Enzyme siteボタン をクリックします。すると左の確認メッセージが表示されるので、Yesを応えます。

9.フィーチャーマップに表示されている塩基配列の両末端をみると、それぞれの制限酵素によって切断された突出末端が付加されていることがみられます。この場合、表示上は、両鎖が表示されていますが、5‘あるいは3’のどちらが突出しているかは保存されていますので、このままライゲーション可能です。ブルーの□で囲まれた塩基は本来はありません。